9778818威尼斯官网:当你谈干细胞时,灵长类早期

上回说到,有一群科学家为了实现“合体”的夙愿,发明了一种叫做“胚胎干细胞囊胚注射”的技术。这种技术可以随心所欲地制造出多种动物的“嵌合体”,却谜一般地无法用在包括人在内的灵长类身上。更悲催的是,就在嵌合体领域的研究者深感困惑之际,半路上还杀出一个叫做“克隆”的新技术,短短几年就抢尽风头,几乎一举宣告了“合体”之路的终结。

你侬我侬,忒煞情多。情多处热如火。

8月28日,《基因组研究》(Genome Research)以Single cell RNA-sequencing reveals the existence of naive and primed pluripotency in pre-implantation rhesus monkey embryos为题,在线发表了中国科学院昆明动物研究所郑萍课题组和中国科学院上海生命科学研究院计算生物学研究所韩敬东课题组合作的研究成果。该研究通过单细胞转录组方法,分析了猕猴着床前胚胎发育过程中,早期细胞命运分化调控,并重点研究了四个囊胚发育阶段(早期囊胚,中期囊胚,晚期囊胚,孵化囊胚)和上胚层细胞(Epiblast cells)多能性的动态变化。发现猕猴早期胚胎细胞命运决定模式和调控与人类胚胎极其相似,首次揭示了灵长类着床前胚胎中存在发育多能性由原始态向始发态的转变过程。

21世纪初对于干细胞学界来说是个多事之秋。干细胞研究需要干细胞,然而在2006年以前,想要获得干细胞,要么得从正常发育的胚胎中提取,要么得借助于体细胞核移植重编程技术,也就是所谓的“克隆”,但是这两种方法都会扼杀一个具有出生潜力的胚胎。社会上对此的口诛笔伐简直铺天盖地,伦理问题的软肋与学术丑闻带来的负面影响几乎压垮了这个初露锋芒的学术领域。

中科院昆明动物所郑萍团队和中科院上海生命科学研究院计算生物学所韩敬东团队合作,研究发现猕猴早期胚胎细胞命运决定模式和调控与人类胚胎极其相似,首次揭示了灵长类着床前胚胎中存在发育多能性由原始态向始发态的转变过程。相关成果近日发表于《基因组研究》。 发育多能性是指一种细胞分化为其他细胞类型的潜能。在早期胚胎发育过程中,胚胎细胞的多能性随着发育的推进而逐渐下降。多能性状态随发育程度不同可分为原始多能态和始发多能态。原始多能态较始发多能态具更强的嵌合体形成能力和发育潜能。啮齿类动物着床前的上胚层细胞处于原始多能态,在着床后转换为始发多能态,因此很容易从着床前胚胎中建立具原始多能态的胚胎干细胞系。但在灵长类中,早期胚胎多能性状态的变化模式尚不清楚。

东山再起:“融合”不成,“黏合”出一个灵长类嵌合体

克隆技术盛极一时,绵羊“多莉”的大名一度无人不知。但历史是如此惊人地相似,克隆技术几乎精确重复了嵌合体技术走过的峥嵘岁月——它一路繁荣,却在灵长类的克隆上却走得无比命途多舛[1]

从2007年起,作为长江后浪的诱导多能干细胞(iPSC)技术强势崛起,轮到克隆技术由盛转衰,利用克隆技术编辑灵长类基因的想法也随之变成了镜花水月。也正是这时候,科学界终于决定重新审视灵长类嵌合体技术的可能性,嵌合体技术开始了它的涅槃重生。

而迈出这关键一步的人,正是研究灵长类胚胎干细胞的泰斗级人物,美籍哈萨克斯坦裔科学家沙乌科莱特·米塔利波夫(Shoukhrat Mitalipov)。

9778818威尼斯官网 1沙乌科莱特·米塔利波夫。图片来源:wikipedia.org

如何才能获得灵长类的嵌合体?在无数干细胞学家的心中,这个难题仿佛是一片永远挥之不去的阴霾。无数前辈前赴后继却无功而返,到21世纪初,一般人已不敢去冒险涉足这个领域。

但米塔利波夫不是一般人。

既然直接注射灵长类胚胎干细胞不能获得嵌合体,米塔利波夫的团队尝试回归原始:直接将一只猕猴囊胚的内细胞团直接移植到另一只的囊胚腔中,这也是历史上第一只嵌合体小鼠的制作方法。

万万没想到,这两个内细胞团却并未融合到一起,而是分别形成了独立的猕猴胚胎,使代孕母猴怀上了双胞胎[2]

“合体”再次失败。

要是一般人,做到这份上也该放弃了。但米塔利波夫团队一不做二不休,决心再搏一把。凭借多年的胚胎操作经验,他们设计了一种极具创意的方法——把3个还处于四细胞期的猕猴胚胎直接黏在一起。

终于,他们成功了,几天后,三个猕猴胚胎如愿以偿地愈合到了一起。利用直接黏合胚胎这种听起来简单粗暴的方法,米塔利波夫的团队在人类历史上第一次实现了灵长类的“合体”[2]

9778818威尼斯官网 2米塔利波夫为了探索灵长类嵌合体所设计的三个实验。图片来源:参考资料[2]

把一块泥,捻一个你,

发育多能性是指一种细胞分化为其他细胞类型的潜能。在早期胚胎发育过程中,胚胎细胞的多能性随着发育的推进而逐渐下降。从受精卵到早期的卵裂球,细胞具发育全能性(totipotency),能发育为胚胎和胚外组织;而当胚胎发育至囊胚期,内细胞团的上胚层细胞(Epiblast cells)便失去了发育形成胚外组织的能力,但仍保留形成胚体的能力,即发育多能性(pluripotency)。多能性状态随着发育程度的不同,可以分为原始多能态(Naive pluripotency)和始发多能态(primed pluripotency)。原始多能态较始发多能态具更强的嵌合体形成能力和发育潜能,两者在雌性细胞X染色体的激活状态、表观遗传特征、代谢特征及多能性调控网络等方面存在显著差异。

可就在这个时候,一种震惊世界的新技术,却像是灰烬中涅槃重生的凤凰一样出现在世人面前,它不但可以为科学家和医生们源源不断地提供优质的干细胞,而且还很巧妙地绕开了一切伦理问题。这种神奇的新技术就是诱导重编程多能干细胞技术(induced pluripotent stem cells,iPS)。

研究人员收集了猕猴囊胚发育的4个时期(早期囊胚、中期囊胚、晚期囊胚、孵化囊胚)和上胚层细胞多能性的动态变化信息,发现灵长类着床前胚胎细胞的发育多能性存在不同的状态。在早中期囊胚时期,上胚层细胞处于原始多能态,此后原始多能性特征丢失,逐步获得始发多能态特征。因此,不同于啮齿类,灵长类的原始多能态存在的时间窗口极其短暂。该研究解释了灵长类原始多能态胚胎干细胞难以获得的原因,也为如何从囊胚中建立具原始多能态灵长类多能干细胞提供了时间窗口。

总结教训:“合体”失败是因为胚胎干细胞不够“幼稚”

米塔利波夫还在同一篇论文中推断了前人不能获取嵌合体猴的原因——体外培养的胚胎干细胞的“状态”有问题[2]

研究者意识到,体外培养的胚胎干细胞其实存在两种不同的“状态”(State): “幼稚态”(Naïve State)和 “启动态”(Primed State)[3]

打个比方,我们的身体就像是一个社会,其中每一个体细胞都被训练得高度“专业”以适应自己的功能。而胚胎干细胞就像是还没有接受过任何专业训练的学生, 具有从事各种职业的潜能。

其中,“幼稚态”的胚胎干细胞好比是小学生,还没有任何专业倾向,因此成长为任何职业都没问题;而“启动态”的胚胎干细胞就好比是大学生,虽然也叫学生,但实际上已经有了专业分化,尽管还存在跨专业求职的可能性,但是基本都会在本专业范围内找工作。

大部分哺乳动物的发育机制比较灵活,它们的“大学生”想要换专业虽然不容易,但也不是不可能;而灵长类的发育机制则非常死板,对于“转专业”的容忍度极低,甚至还会故意排斥“计划外”的大学生。

9778818威尼斯官网 3图中是一些体外培养的小鼠胚胎干细胞。黑色箭头所指的是“幼稚态”胚胎干细胞的团块,红色箭头所指为“启动态”胚胎干细胞。这两种不同状态的胚胎干细胞截然不同的形态特征。图片来源:参考资料[3]

问题的关键,正在于汤姆森等科学家所用培养灵长类胚胎干细胞的培养液,恰好会把它们诱导成“高年级的大学生”——还去了不太好找工作的专业。

米塔利波夫这一假说可谓一举重燃了全世界制造灵长类嵌合体的热情。瞬息之间,嵌合体研究原地满血复活了。

塑一个我,将咱两个,

已知在啮齿类中,着床前的上胚层细胞处于原始多能态(Naive pluripotency),在着床后转换为始发多能态(Primed pluripotency),因此很容易从着床前胚胎中建立具原始多能态的胚胎干细胞系。在灵长类中,早期胚胎多能性状态的变化模式尚不清楚。但是,从人和非人灵长类着床前胚胎中建立的胚胎干细胞系,都表现出始发多能态特征,提示灵长类早期胚胎的多能性变化模式可能不同于啮齿类。

盗细胞的梦

细胞存在两种不同的类型:一种是分裂缓慢,且不再具有转变成其它类型细胞潜力的“体细胞”;另一种是分裂旺盛,并且具有可以转变类型能力的“干细胞”,其中又有一类几乎可以转变成一切细胞类型的“多能干细胞”。传统上,只有胚胎发育的特定时期才会存在的胚胎干细胞,是正常生物所能产生的唯一一种“多能干细胞”。多年来,无数科学家都在努力寻找一种可以简单方便制取多能干细胞的方法。

在诺兰导演的科幻巨制《盗梦空间》中,主角为了让身陷梦中不能自拔的妻子脱离梦境,潜入妻子的意识深处植入了一个“这一切都是梦”的强烈信念,于是他的妻子终于幡然醒悟,和主角一起离开了那个虚幻的梦境。是否有一种方法,可以像《盗梦空间》里一样给体细胞植入一个“信念”,使之逆转成多能干细胞呢?

2005年,日本京都大学的山中伸弥(Yamanaka Shinya)教授就决定要挑战一下这个不可思议的任务。他在干细胞领域工作多年,而且自主研发出了Fbx15系统,可以很容易地知道体细胞究竟有没有被重编程成多能干细胞。在做了大量前期准备工作后,山中伸弥挑选出了24个候选基因,这些基因在胚胎干细胞中都非常活跃,而在体细胞中则几乎是完全被抑制的。配合他的高效筛选系统,山中伸弥或许能找出将体细胞重编程为多能干细胞的方法。

这在学术上是个相当冒险的举动:尽管这些基因的活跃程度与细胞的类型密切相关,但是谁也不知道这其中究竟谁是因,谁是果。山中伸弥猜测,能给体细胞植入“重编程信念”的关键就在那24个基因当中。但谁也不能写包票。

思前想后,山中伸弥决定让他的学生兼助手高桥和利(Takahashi Kazutoshi)来承担这个研究任务,因为高桥和利在之前已经发表了一篇很不错的论文,即使这项研究最终一无所成,也不会太影响这位学生的前途。高桥和利没想太多,就爽快地跳了这个坑。

9778818威尼斯官网 4发表发现iPS论文的两位作者:山中伸弥(左)和他的学生高桥和利(右),图片来源:naist.jp

相关论文信息:DOI: 10.1101/gr.233437.117

目标明确:要“合体”,先设法让胚胎干细胞“幼稚”到底

米塔利波夫的一语道破,令各路科学家誓要不择手段地把胚胎干细胞都变成像名侦探柯南一样的万年小学生。短短两年,各种号称可以将灵长类胚胎干细胞转化成“幼稚态”的培养体系如雨后春笋般迸发出来。

其中,有五大体系最为引人注目:干细胞学界一代宗师鲁道夫·詹尼士(Rudolf Jaenisch)主导开发的詹尼士体系 [4];北京大学邓宏魁团队所开发的邓宏魁体系 [5];以色列科学家雅各布·翰拿(Jacob H. Hanna)等开发的翰拿体系[6];美国“命运疗法公司”(Fate Therapeutics, Inc.)开发的弗林体系[7];美国生物化学家汉内莱·罗霍勒-贝克(Hannele Ruohola-Baker)等开发的贝克体系[8]。它们堪称灵长类胚胎干细胞学界的“五岳剑派”。

武林高手用拳脚论高下,而科学家则要用实验来分伯仲。最终决定胜负的必须是嵌合体实验,但是在数年时间内他们没有一家敢轻易尝试去直接制造嵌合体猴。

打响试探第一枪的是邓宏魁。

2014年,邓宏魁团队将他们培养的“幼稚态”猕猴诱导多能干细胞注射到了小鼠的囊胚当中。结果邓宏魁的团队在一部分发育到10.5天的小鼠胚胎当中找到了极其微量的嵌合痕迹。但再怎么微量,这也是人类历史上首次通过囊胚注射的方法获得带有灵长类细胞的嵌合体。此后,他很快又和中国最大的非人灵长类实验平台中科院昆明动物研究所宣布合作。

全力开展灵长类嵌合体的攻关任务,眼看着将要被邓宏魁拔得头筹。

一齐打破,用水调和,

为了研究灵长类早期胚胎多能性的动态变化,研究人员收集了猕猴囊胚发育的4个时期,对每个时期上胚层细胞进行了单细胞转录组分析,通过在蛋白编码基因层面以及非编码因子层面(包括转座子和长非编码RNA)的分析,以及构建多能性网络相关基因等计算方法,发现灵长类着床前胚胎细胞的发育多能性存在不同的状态。在早期(Early blastocyst)和中期囊胚(Middle blastocyst)时期,上胚层细胞处于原始多能态,此后原始多能性特征丢失,并逐步获得始发多能态特征。因此,不同于啮齿类,灵长类的原始多能态存在的时间窗口极其短暂。该研究解释了灵长类原始多能态胚胎干细胞难以获得的原因,也为如何从囊胚中直接建立具原始多能态灵长类多能干细胞提供了适合的时间窗口。

师徒同心,柳暗花明

一项跨时代的伟大研究就此开始。

首先,山中伸弥让高桥和利准备了24株小鼠成纤维细胞——一种常用于实验的小鼠体细胞,让这些细胞分别过表达(overexpression)24个候选基因中的一个基因。结果非常悲惨,24株小鼠成纤维细胞没有一株成功地重编程成多能干细胞。眼看自己几个月的艰苦工作落得一场空,高桥和利泄气了,气冲冲地跟老板抱怨了一番。而山中伸弥只能安慰他说:“这个至少说明咱们的Fbx15检测系统很可靠啊,没有出现假阳性的问题。”

但导师的安慰毕竟解决不了实际问题,一筹莫展之下,高桥和利提出,干脆在一株细胞里把那24个基因一股脑全都过表达算了。这个想法颇有些死马当活马医的意味,不过既然自己的学生不嫌麻烦,山中伸弥也就随他去了。

事实证明,孤注一掷也是可以成功的。同时过表达24个候选基因后,居然真的有一小部分成纤维细胞成功逆转成了多能干细胞——这是人类有史以来第一次从胚胎以外的地方获得了有应用价值的多能干细胞。

这下子山中伸弥心里有底了,但这时他又有了别的担忧。要知道“有人的地方就有江湖”,学术界也从来没有常人想的那么和平。远有牛顿与莱布尼兹的相爱相杀,近有克隆人类胚胎干细胞竞赛的你死我活,山中伸弥可不想重蹈前人的覆辙。他立刻嘱咐高桥和利要从现在开始高度保密,不得再对任何人提及他们的研究进展。在另一方面,师徒两人也加快了后续研究的步伐。

他们通过简单的排除法从24个候选基因中筛选出10个特别重要的基因,之后又从这10个基因中再精选,想方设法减少需要过表达的基因的数量。筛选到最后,他们的候选名单中只剩下了4个基因——Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4,这四个基因少了任何一个都难以诱导小鼠成纤维细胞逆转成多能干细胞。山中伸弥将这个能够为细胞植入“重编程信念”的基因组合命名为“山中因子”(Yamanaka Factors),并将他所得到的这些多能干细胞命名为“诱导多能干细胞”(Induced pluripotent stem cells)。这种崭新的细胞与传统的胚胎干细胞无论是形态还是分子特征都高度相似,并且拥有良好的多能性。尽管可能是一时碍于条件限制,山中的团队在当时(2006年)还没能用这种细胞制作出小鼠个体,但是他对于自己的新突破充满了希望。

山中伸弥是个颇有浪漫情怀的人,他看到当时苹果的iPod卖得很火,便希望自己发明的这种新技术以后也会像iPod一样走进千家万户,于是便比着iPod的名称将自己的新技术简写为iPS。(笔者注:上述研究过程参考了山中伸弥的论文[1]以及他在NIH所做的学术报告[2]。)

9778818威尼斯官网 5iPS细胞制备流程示意图。①:体外培养体细胞;②:通过慢病毒载体向细胞转入山中因子,红色表示表达外源性山中因子的细胞;③:将细胞转移到胚胎干细胞培养基;④:iPS细胞形成胚胎干细胞样的细胞团块。图片来源:Y tambe/ wikipedia.org,文字来自[14],有改动。

2007年,山中伸弥的研究团队与来自麻省理工学院(MIT)的基因修饰技术先驱鲁道夫·詹尼士(Rudolf Jaenisch)实验室各自独立制作出了基于iPS技术的嵌合体小鼠[3][4]。从此iPS细胞终于完成了从“养在盘子里”到“养在笼子里”的跨越,嵌合体小鼠是检验干细胞多能性的最高标准,从此iPS细胞的多能性就再也没有争议了。不久之后,他的实验团队又和干细胞学界巨擘詹姆斯·汤姆森(James A. Thomson)的团队各自独立制作出了人类iPS细胞[5][6]。这就意味着iPS技术经受住了同行重复实验的考验,获得了主流学术界的认可。从此,iPS技术名动天下,以至于整个干细胞学界都开始为之转向。

9778818威尼斯官网 6利用iPS制造的嵌合体小鼠,图片来源:参考文献[4]

(原载于《中国科学报》 2018-09-06 第1版 要闻)

干细胞“合体”的胜利:用“非主流”方法构建灵长类嵌合体

然而不久之后,事情却有了出人意料的发展。

2015年7月,当邓宏魁的研究还没有传出任何消息的时候,中科院北京动物研究所的副所长周琪和昆明灵长类转化医学研究中心的季维智、李天晴突然宣布,他们已经率先合作完成了食蟹猴嵌合体的构建工作。

9778818威尼斯官网 7率先利用“幼稚态”胚胎干细胞获得灵长类嵌合体的三位科学家。自左向右:周琪,季维智,李天晴,其中李天晴的团队是大部分研究工作的直接承担者。图片来源:北京动物研究所与昆明灵长类转化医学研究中心官网

万众期待的灵长类嵌合体被制造出来了,用的体系却不是邓宏魁的——在这新一轮的“华山论剑”中,原本并不算最出众的翰拿体系[6]逆袭了。李天晴等科学家以翰拿体系为基础并加以改进,设计出了一种新的复合体系[9],利用被他们称为“类幼稚态”(Naïve like State)的胚胎干细胞,完成了这项壮举。

9778818威尼斯官网 8李天晴等人体外培养的食蟹猴“类幼稚态”胚胎干细胞。右图为左图中一个单独细胞团块(白色方框)的放大。图片来源:参考资料[9]

李天晴等人在制作食蟹猴嵌合体的方法上也进行了一些革新。它们摒弃了传统的囊胚注射,而是采用相对“非主流”的桑椹胚注射法。他们成功制作了14枚食蟹猴嵌合体囊胚,并很小心地把这些囊胚移植到5只代孕母猴体内。由于经过人工操作的食蟹猴胚胎存活率较低,所以他们给每只母猴都移植了两到三枚胚胎。

5只代孕母猴中,有4只都未能成功受孕,而剩下的一只,则一下子怀上了双胞胎。这可不是什么好事:食蟹猴子宫较小,怀上双胞胎的话很有可能会导致两个胎儿一齐流产,而食蟹猴又有吞噬流产幼崽的习性。经过反复权衡后,李天晴的团队决定在怀孕到100天的时候(食蟹猴正常怀孕周期大约是160天),提前将食蟹猴胎儿剖腹取出。

9778818威尼斯官网 9李天晴等科学家制作食蟹猴嵌合体的流程。图片来源:参考资料[9]

经检测,这两只食蟹猴胎儿都是嵌合体,而且它们的嵌合比率都达到了较高水平,在不同的器官中,嵌合比率普遍可以达到1%到18%,有理由认为,如果让这两只嵌合体胎儿成功出生的话,它们已经可以满足相当多实验的需求。

尽管没有得到活的嵌合体猴个体略让人遗憾,但是他们的工作终于打破了灵长类“合体”的最后一道禁制,带来了新时代的曙光。

既不因畏惧后浪推前浪而深藏不露,也不因盲目崇古而固步自封,一代代人薪火相传,正是科学有别于其它思想的关键所在。加德纳,马丁爵士,汤姆森,米塔利波夫,翰拿,李天晴……无数科学家的继往开来,终得以将“合体”这样的天方夜谭最终变为现实,正是最典型的一例明证。

(编辑:Calo)

再捻一个你,再塑一个我。

韩敬东课题组的刘登辉和郑萍课题组的王鑫轶、何大健、孙春丽为文章共同第一作者,韩敬东和郑萍为文章共同通讯作者。该工作得到中科院先导专项B(XDB13010600)、先导专项A(XDA01010203,XDA01010303),以及动物进化与遗传前沿交叉卓越创新中心等的支持。

在“前浪”下崛起

不得不说,这新生的iPS技术较之任何一种传统的制备多能干细胞的技术都有很大的优势:它方便,廉价而且没有任何伦理问题,所以一出现就有颠倒乾坤之势。这对于当时主要精力还放在克隆技术上的干细胞学界来说无异于一记晴天霹雳——有了iPS,为何还要大费周章去克隆呢?

但“后浪”要称雄,还没到时候。

一轮对iPS的批判不久拉开序幕,一时之间,学术界仿佛开起了对iPS的批斗大会。对iPS的批判五花八门,有的人相信iPS会导致基因突变[7],有些人则认为iPS的诱导过程会造成某些特定的遗传缺陷[8],也有人发现iPS细胞的表观遗传状态与传统来源的胚胎干细胞存在差异[16]。甚至到最近,依然有人提出iPS技术存在多项技术缺陷,核移植重编程才是重编程技术的“金标准”[9]。在他们口中,iPS终究只能是科学家在实验室里玩玩的花哨玩意,要想治病救人还得靠“传统”的克隆技术才行。

9778818威尼斯官网 10两种重编程技术手段对比图。图片编译自参考资料[13]

在iPS技术尚未成熟的早期,这些指责倒也并非完全没有道理。山中伸弥等人也意识到,利用iPS技术获得的嵌合体小鼠具有极高的患癌风险[2]。也正是在iPS学派与克隆学派的口水仗中,人们看到了iPS的有待改进之处。山中伸弥等科学家们自然不会坐以待毙,他们开始尝试改进iPS技术。

iPS的这些问题主要有两方面的原因。其中之一便出在“山中因子”当中,四个山中因子里头,c-Myc是一个非常敏感的原癌基因,它堪称是一个定时炸弹,稍有不慎就会失控继而引发癌症。另一方面,山中伸弥等人过表达山中因子的工具——慢病毒也难逃干系。这种工具自从被鲁道夫·詹尼士发明以来,便凭借其便捷、高效的特点成为生物学家对细胞进行基因修饰的主要工具。但在重编程方面,这种工具存在着巨大的缺点。

还是用《盗梦空间》来打比方:在电影当中,男主角在自己妻子脑中植入了脱离梦境的信念。这个信念虽然促使他的妻子离开了梦境,但是这个信念太强烈了,以至于妻子回到现实中以后还觉得自己在梦中,而这最终导致了妻子的自杀。同样地,慢病毒虽然方便,但是它过表达基因的能力过于强烈,以至于那些重编程的干细胞在重新分化回体细胞以后还“觉得”自己是个多能干细胞,因此就有可能继续像一个多能干细胞那样无限分裂。而体细胞失控地无限分裂,就是我们平时所谓的癌症。更麻烦的是,慢病毒不但“威力猛”而且还“下手狠”,它会随机地破坏掉细胞内的一些基因序列,这就好比是在“盗梦”的同时还顺带搞坏了对方的大脑。因此通过慢病毒工具制作出来的iPS细胞会有种种问题也就不足为奇了。

不过好在有诸如詹尼士以及汤姆森之类的大腕给iPS撑腰,批评者的口水一时半会儿也淹不死这个崭露头角的新技术。而iPS学派的众人也不敢懈怠,连忙加班加点地研究怎么攻克这些短板。

慢病毒肯定是不能再用了,科学家们转而采用更加温和的方法。不久之后,借助于转染mRNA[10]甚至蛋白质[11]来诱导重编程的技术被相继推出。这些新技术不会损伤体细胞的基因,而且效力也弱得多。如果说使用慢病毒诱导是“盗梦”的话,那么这些手段更加接近于“传销洗脑”,只要事后再“反洗脑”一番,细胞还是有不小的几率“幡然醒悟”的。

另一方面,随着iPS技术的日趋完善,人们渐渐发现山中伸弥团队遴选出来的4种山中因子还可以进一步精减。少改变一个基因就可以少一分成本和风险,因此科学家们在这方面投入了大量的精力。最先被剔除的自然就是那个“定时炸弹”——c-Myc,2008年一月,山中伸弥和鲁道夫·詹尼士各自独立开发出了不依赖于c-Myc,只用到3个山中因子的重编程新技术[12][17]

 

尽管较之“简单粗暴”的慢病毒法,后来的新技术要更加繁琐,但是它们有效化解了iPS所面对的种种非难。2014年下半年,国际上几位干细胞学界的领军人物迪亚特·艾格力(Dieter Egli)、尼森·本范尼斯蒂(Nissim Benvenisty)和沙乌科莱特·米塔利波夫(Shoukhrat Mitalipov)共同对iPS技术来了场“三堂会审”,结果证实,通过iPS技术得到的多能干细胞与通过克隆技术得到的胚胎干细胞在安全性上没有区别[13]。由于艾格力和米塔利波夫都是克隆学派的“掌门”级大腕,他们一发话,泛泛之辈也就再不敢吱声了。自此,两大重编程学派之争尘埃落定。

参考资料:

  1. 鬼谷藏龙,克隆人离我们还有多远?
  2. Tachibana, M., Sparman, M., Ramsey, C., Ma, H., Lee, H. S., Penedo, M. C. T., & Mitalipov, S. (2012). Generation of chimeric rhesus monkeys. Cell, 148(1), 285-295.
  3. Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., ... & Smith, A. (2008). The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature, 453(7194), 519-523.
  4. Theunissen, T. W., Powell, B. E., Wang, H., Mitalipova, M., Faddah, D. A., Reddy, J., ... & Jaenisch, R. (2014). Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency. Cell Stem Cell, 15(4), 471-487.
  5. Fang, R., Liu, K., Zhao, Y., Li, H., Zhu, D., Du, Y., ... & Deng, H. (2014). Generation of naive induced pluripotent stem cells from rhesus monkey fibroblasts. Cell stem cell, 15(4), 488-496.
  6. Gafni, O., Weinberger, L., Mansour, A. A., Manor, Y. S., Chomsky, E., Ben-Yosef, D., ... & Hanna, J. H. (2013). Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature, 504(7479), 282-286.
  7. Valamehr, B., Robinson, M., Abujarour, R., Rezner, B., Vranceanu, F., Le, T., ... & Flynn, P. (2014). Platform for induction and maintenance of transgene-free hiPSCs resembling ground state pluripotent stem cells. Stem cell reports, 2(3), 366-381.
  8. Ware, C. B., Nelson, A. M., Mecham, B., Hesson, J., Zhou, W., Jonlin, E. C., ... & Ruohola-Baker, H. (2014). Derivation of naive human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(12), 4484-4489.
  9. Chen, Y., Niu, Y., Li, Y., Ai, Z., Kang, Y., Shi, H., ... & Li, T. (2015). Generation of Cynomolgus Monkey Chimeric Fetuses using Embryonic Stem Cells. Cell stem cell, 17(1), 116-124.

我泥中有你,你泥中有我……[1]

文章链接

改朝换代?

2012年,克隆技术的开山祖师约翰·戈登(John Gurdon)和iPS技术的发明人山中伸弥共同获得了当年的诺贝尔生理学或医学奖。但那个时候,约翰·戈登早已“转投”iPS学派门下了。事实上,不只是他,克隆技术领域一连串有头有脸的人物都先后转向了iPS或是单倍体胚胎干细胞技术(后来随着CRISPR/Cas9技术的出现,这拨人又悲剧了……)的研究中。

这其中的道理并不难理解。本来一“卵”难求的人类卵细胞就一直让人类核移植技术研究的成本居高不下,“黄禹锡事件”造成的负面影响更是让这些科学家们本就吃紧的财政状况雪上加霜。一些科学家虽然嘴炮放得响亮,但私底下都已是心猿意马。随着学术界的风向一点点地偏向iPS,克隆学派门下越来越多的人“跳槽”到了别的研究领域中去。

疯狂的克隆时代走向终结,干细胞学界步入了iPS的纪元,一朝天子一朝臣,那些克隆技术领域的元老们,纵然有千般不舍,也只得接受着长江后浪推前浪的命运。纵观整个科技史,这种江山易手的事情可能并不鲜见,而每一次变革,都总有一些人特别令人扼腕。

若山照彦(Teruhiko Wakayama)是世界上第一个成功克隆小鼠的科学家,在克隆领域享有崇高的威望。他在iPS时代到来后也并没有转变他的研究方向,在十多年的研究中,他将小鼠的克隆效率提升了好几十倍。可是当他回过神来的时候,却发现世道早就变了——在iPS和CRISPR/Cas9等新技术的狂潮下,他的工作竟然显得那么无足轻重。

更有点“躺枪”意味的是笹井芳树(Sasai Yoshiki)。在山中伸弥之前,此人堪称是独霸日本干细胞学界的一代宗师。笹井毕业于名牌高校京都大学,又在海外深造多年,更曾求学于约翰·戈登这样的大师门下。海归后年纪轻轻(36岁)就当了教授,之后无论学术还是仕途都是一路顺风顺水。而山中伸弥毕业于一个相对一般的大学(大阪市立大学,大概相当于日本一线大学的中等水平)。毕业后做了个骨科大夫,但是手术做得不好,后来便转入基础学科领域。他先去美国研究脂代谢,后来慢慢将关注点转到胚胎干细胞上。刚回国后,山中在大阪的起步异常艰难,不但申不到科研经费,甚至都没什么学生肯跟着他混,让他差一点就回去重新操刀做骨科大夫了。

可这一切在山中伸弥获得诺贝尔奖以后就都变了。本来笹井是日本人最为看好的诺贝尔奖竞争者,可是2012年后,笹井“高富帅”的形象完全隐没在了山中的万丈光芒中,世人只知有山中而不知有笹井。后来的事情大家也知道了,若山和笹井两个人以自己一生的名誉为赌注押到了小保方晴子的“新突破”上,结果落得一个接受调查,一个自缢身亡的下场[14]。虽然个中缘由还有待评说,但不得不说他们是改朝换代的牺牲品。

9778818威尼斯官网 11笹井芳树(中)、若山照彦(右)和小保方晴子(左)在一起。笹井芳树和若山照彦本来都是干细胞学界的领军人物,但都卷入了小保方晴子的学术造假事件中。图片来源:so-net.ne.jp

笹井自尽后,时任国际干细胞学会主席的山中伸弥第一时间为其发布了悼文,也算是这两人多年瑜亮情结的一个诠释。悲剧令人惋惜,但是时代的车轮依然在滚滚向前。就在小保方事件接近尾声的时候,笹井的师妹高桥政代(Takahashi Masayo)在山中伸弥的技术支持下,首次将iPS技术用于临床试验[15]

如果从核移植重编程技术算起,已经走过了大半个世纪风风雨雨的体细胞重编程技术终于摸到了临床应用的门槛。iPS技术将会干细胞学界以及亿万期待它救死扶伤的公众带来怎样的未来,请诸君拭目以待吧。

 

感谢@慕容轩道 提供资料和@laminin 批评指正。

(编辑:Calo)

文章题图:giphy.com

在传统文化中,合体似乎是一种情侣之间恩爱到极致的表现。不但中国如此,在希腊神话中,湖中水仙萨耳玛西斯(Salmacis)对赫马佛洛狄忒斯(Hermaphroditus)也爱得深沉,向天许愿要和他永远在一起。于是神满足了她的愿望,啪一下,这对异性恋就合体了,后来成为一个雌雄同体的神。于是,赫马佛洛狄忒斯的名字也就成了 “雌雄同体”(Hermaphrodite)一词的词源。

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参考资料:

  1. Takahashi, K., & Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. cell,126(4), 663-676.
  2. Okita, K., Ichisaka, T., & Yamanaka, S. (2007). Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature, 448(7151), 313-317.
  3. Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., ... & Jaenisch, R. (2007). In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature, 448(7151), 318-324.
  4. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., & Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. cell, 131(5), 861-872.
  5. Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., ... & Thomson, J. A. (2007). Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 318(5858), 1917-1920.
  6. Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., ... & Zhang, K. (2011). Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature, 471(7336), 63-67.
  7. Hussein, S. M., Batada, N. N., Vuoristo, S., Ching, R. W., Autio, R., Närvä, E., ... & Otonkoski, T. (2011). Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature, 471(7336), 58-62.
  8. Ma, H., Morey, R., O'Neil, R. C., He, Y., Daughtry, B., Schultz, M. D., ... & Mitalipov, S. (2014). Abnormalities in human pluripotent cells due to reprogramming mechanisms. Nature, 511(7508), 177-183.
  9. Kawai T, Takahashi K, Sato S, et al. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I-and Mda5-mediated type I interferon induction[J]. Nature immunology, 2005, 6(10): 981-988.
  10. Zhou, H., Wu, S., Joo, J. Y., Zhu, S., Han, D. W., Lin, T., ... & Ding, S. (2009). Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell stem cell, 4(5), 381-384.
  11. Wernig, M., Meissner, A., Cassady, J. P., & Jaenisch, R. (2008). c-Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts. Cell stem cell, 2(1), 10-12.
  12. Johannesson, B., Sagi, I., Gore, A., Paull, D., Yamada, M., Golan-Lev, T., ... & Egli, D. (2014). Comparable Frequencies of Coding Mutations and Loss of Imprinting in Human Pluripotent Cells Derived by Nuclear Transfer and Defined Factors. Cell stem cell, 15(5), 634-642.
  13. 果壳网,小保方晴子传:2014年度学术丑闻
  14. 果壳网,首个临床试验获批:iPS终于能被用于人体
  15. Ma, H., Morey, R., O'Neil, R. C., He, Y., Daughtry, B., Schultz, M. D., ... & Mitalipov, S. (2014). Abnormalities in human pluripotent cells due to reprogramming mechanisms. Nature, 511(7508), 177-183.
  16. Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Takahashi, K., Ichisaka, T., Aoi, T., ... & Yamanaka, S. (2008). Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature biotechnology, 26(1), 101-106.

而在现代通俗文化中,合体已不仅仅是异性恋的专利了,从孙悟空贝吉塔到葫芦娃七兄弟,一经合体,战斗力瞬间飙升几个数量级,让电视机前的小朋友们个个热血沸腾,恨不得马上拉上个小伙伴去合体战斗。

灵长类和啮齿类早期胚胎具不同的多能态变化特征。

文章题图:livedoor.jp

9778818威尼斯官网 13通俗意义上的“合体”,大概就是这么一回事。图片来源:tumblr.com

那么,科学会允许我们“合体”吗?

自然发生的“合体”:非常罕见,“成品”极少

显然,要想把两个大活人合体到一块,可不是揉揉碎混混匀再捏两下这么简单的。不过,如果把“合体”的范畴稍微拓宽一些,这事却也还有商量的余地。

在自然状态下,处于胚胎阶段的两个个体会有极其微小的几率“融合”到一起——最后,这两个胚胎的细胞会像充分混匀的红豆和绿豆一样难以分开,共同组成一个婴儿。

在希腊神话中,有一种由狮、蛇、羊三种动物彼此嵌合而成的怪物叫做喀迈拉(Chimera),早期的科学家们化用了这个典故,将这些由多个胚胎融合而成的个体也命名为“喀迈拉”。只不过,当初将它翻译成汉语的人似乎对神话并不感冒,直接将Chimera意译成了“嵌合体”。

自然发生的嵌合体非常罕见。不少情况下,胚胎融合诞生出的都是融合到一半的“半成品”,也就是我们常说的连体婴儿。由此看来,“合体”这种“不自然”的事情,交给大自然似乎也不是那么靠谱。

但是这类现象却深深地启发了科学家们,他们迅速意识到,尽管动物的成体不能直接融合,但是至少在胚胎发育的某个阶段里面,两个独立的胚胎存在水乳交融的可能性。对科学家们而言,“合体”不但是一个有趣的研究课题,更可能是一种研究动物胚胎发育机制的潜在手段。

有趣归有趣,但真的做起来,这就不那么简单了。不,应该说是困难重重才对:

一、黑白小鼠“合体”:未被重视的成功案例

经过反复摸索,他们将“合体计划”锁定在了胚胎早期一个特殊的阶段——囊胚(Blastocyst)。

9778818威尼斯官网 14哺乳动物早期胚胎发育过程。我们每一个生命体都来自于一个叫做“受精卵”(zygote)的全能细胞,随后,这个巨大的细胞便会一分二,二分四,形成一个包含数十个卵裂球的“桑椹胚”(Morula),在桑椹胚阶段,胚胎发生第一次细胞分化,并产生一个腔隙而形成囊胚。原图来源:wikipedia.org/

囊胚在结构上可以分为两个部分,一个是外围的“滋养外胚层”,另一个则是内部的“内细胞团”——这一团当中的细胞,便是大名鼎鼎的“胚胎干细胞”。组成我们身体器官的每一个细胞,都是这团胚胎干细胞的后代。

理论上讲,只要把来自两个囊胚的胚胎干细胞混到一起,就有可能弄出个嵌合体来。基于“人类未动,小鼠先行”这条生物学研究铁律,1968年,剑桥大学的生理学家加德纳(R. L. Gardner)首先将一只黑毛小鼠囊胚的内细胞团塞到了一只白毛小鼠的囊胚腔中[2]

在发育的过程中,这两只老鼠的内细胞团融合到了一起,最后出生了一只黑白相间的“奶牛色”小鼠——这首次证明了人工制造嵌合体的可能性。只不过,在他那个年代,这种工作既缺乏实用价值,也没能如预想般加深太多对胚胎发育机制的理解,因而充其量只能算是科学家的自娱自乐,在学术界并未引起多少关注。

9778818威尼斯官网 15黑白小鼠胚胎“合体”后得到的嵌合体小鼠。图片来源:wikipedia.org

二、体外培养“合体”材料:嵌合体技术登台亮相的大前提

1981年,那是干细胞学界的春天。那一年,剑桥大学的生物学家马丁·埃文斯爵士(Sir Martin John Evans)与马修·考夫曼(Matthew H. Kaufman)[3],和美国加州大学教授盖尔·马丁(Gail Roberta Martin)[4]几乎同时发明了小鼠胚胎干细胞的体外培养技术。

9778818威尼斯官网 16胚胎干细胞学的开创者马丁·埃文斯爵士。图片来源:wikipedia.org

他们将小鼠的胚胎干细胞从囊胚中分离出来,培养在一类可以强烈抑制其分化的特殊培养体系中,使之永远维持在胚胎干细胞的状态。这些具有分化成所有体细胞潜能的细胞,从此不只是在囊胚中的昙花一现。

较之成熟的动物个体,体外培养的细胞更容易实现各种基因编辑,同时又具备着分化成所有类型体细胞的潜力。因此,立刻有人意识到,这很可能带来一场的制造基因编辑动物的技术革命。

但是,光有胚胎干细胞是没法直接产生动物个体的。怎么才能把养在盘子里的胚胎干细胞。变成养在笼子里活蹦乱跳的实验动物呢?这时候,埃文斯爵士注意到了加德纳“奶牛色小鼠”。

他尝试将体外培养的胚胎干细胞直接注射到囊胚腔,结果很幸运地发现,和加德纳在囊胚中混合的内细胞团一样,体外培养的胚胎干细胞可以参与形成嵌合体。

9778818威尼斯官网 17用处巨大的“合体”。图为利用嵌合体技术编辑小鼠基因的一般流程。图片来源:鬼谷藏龙

三、哺乳动物接连“合体”:进程卡在灵长类上

从那以后,新世界的大门被打开了。埃文斯发明的囊胚注射胚胎干细胞技术简单高效,经过后人的改进并臻于成熟后,时至今日都是制造基因编辑动物的主要手段之一。作为胚胎干细胞学的奠基人,埃文斯爵士也由于这项划时代的成就而获得了2007年诺贝尔生理或医学奖[5]

一时间,冒险家们蜂拥而至。

十几年间,大鼠、兔子以及各种家畜的胚胎干细胞也相继实现了体外培养。作为制作基因编辑动物的核心技术,嵌合体技术在科研、畜牧等领域的作用变得举足轻重。从某种意义上说,20世纪的八九十年代,正是嵌合体技术发展得如火如荼的盛夏。

但在这一片繁荣之上,却飘着一朵令人不安的乌云。

与小鼠的巨大成功形成鲜明对比的是,包括人类在内的灵长类胚胎干细胞却始终不能在体外培养。

四、灵长类胚胎干细胞体外培养:千呼万唤始出来

灵长类胚胎干细胞在生物医学研究中的重要性不言而喻。然而,灵长类胚胎干细胞研究不但难度大到令人发指,而且还总是面临着毫不留情的伦理争议,堪称是干细胞学领域的第一大坑,折磨着一代又一代干细胞学家。

好在功夫不负有心人,经过多年求索,美国发育生物学家詹姆斯·汤姆森(James A. Thomson)终于为这个大坑迎来生机:1997年,他成功体外培养了四株猕猴的胚胎干细胞[6],次年他又实现了人类胚胎干细胞的体外培养[7]

9778818威尼斯官网 18世界首个完成灵长类胚胎干细胞体外培养的科学家詹姆斯·汤姆森。图片来源:wikipedia.org

灵长类人工嵌合体的诞生终于近在咫尺了。

五、灵长类“合体”:世纪末的沉重打击

真的近在咫尺了?

并没有。

出乎所有人的预料,尽管汤姆森从灵长类囊胚中分离培养的肯定是胚胎干细胞无误,但是这些胚胎干细胞竟完全无法参与形成灵长类的嵌合体。这个让人崩溃的结果告诉科学家们,干细胞学领域的第一大坑依然还跟以前一样深不见底。

更无奈的是,就在汤姆森实现这项令人丧气的重大突破之时,命运女神仿佛也已经决定弃嵌合体技术而去了。

1997年,那是嵌合体技术肃杀的秋天。那一年,一只名叫“多莉”的绵羊在苏格兰呱呱坠地,伴随它的诞生,一种叫做“克隆”的崭新技术在干细胞领域冉冉升起。有了克隆技术,人们完全可以一步到位地制造出“纯而又纯”的动物。反观嵌合体,再怎么样制造出来的也是多个胚胎“合体”产生的“杂种”。随着越来越多种动物被成功克隆,嵌合体制造技术逐渐开始退居二线。

9778818威尼斯官网:当你谈干细胞时,灵长类早期胚胎发育多能性变化模式获揭示。前有令人毫无头绪的技术瓶颈,后有新生代技术的步步进逼,灵长类嵌合体这条道路,在20世纪的末章,眼看着就要步入死地。

究竟是从此一蹶不振,还是会绝境逢生?在众人的困惑与迷茫中,嵌合体技术的凛冬将至了……

(编辑:Calo)

灵长类的胚胎“合体”之路有没有走进死胡同?嵌合体技术又将走向何方?在《你知道在生物学界,“求合体”有多难吗!(下)》中,文章里的故事将追上现实的进度条,敬请期待。

参考资料:

  1. 宋·管道升《我侬词》
  2. Gardner, R.L. (1968). Mouse chimeras obtained by the injection of cells into the blastocyst. Nature 220, 596–597.
  3. Evans, M. J., & Kaufman, M. H. (1981). Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. nature, 292(5819), 154-156.
  4. Martin, G. R. (1981). Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 78(12), 7634-7638.
  5. Hansson, Göran K. "The 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine - Advanced Information". Nobelprize.org. Retrieved 26 June 2010.
  6. Thomson, J. A., & Marshall, V. S. (1997). 4 Primate Embryonic Stem Cells. Current topics in developmental biology, 38, 133-165.
  7. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., & Jones, J. M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. science, 282(5391), 1145-1147.

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